熒光是指一種光致發(fā)光的冷發(fā)光現(xiàn)象。當(dāng)某種常溫物質(zhì)經(jīng)某種波長(zhǎng)的入射光照射，吸收光能后進(jìn)入激發(fā)態(tài)，并且立即退激發(fā)并發(fā)出比入射光的波長(zhǎng)長(zhǎng)的出射光。
PCR-熒光探針?lè)?/a>利用熒光的原理，當(dāng)光照射到某些原子時(shí)，光的能量使原子核周圍的一些電子由原來(lái)的軌道躍遷到了能量更高的軌道，即從基態(tài)躍遷到第一激發(fā)單線態(tài)或第二激發(fā)單線態(tài)等。第一激發(fā)單線態(tài)或第二激發(fā)單線態(tài)等是不穩(wěn)定的，所以會(huì)恢復(fù)基態(tài)，當(dāng)電子由第一激發(fā)單線態(tài)恢復(fù)到基態(tài)時(shí)，能量會(huì)以光的形式釋放，產(chǎn)生熒光。
PCR-熒光探針?lè)?/strong>的交探針模式(Beacon)：分子信標(biāo)是一種呈發(fā)夾結(jié)構(gòu)的莖環(huán)寡核苷酸探針，兩端的核酸序列互補(bǔ)配對(duì)，因此標(biāo)記在一端的熒光基團(tuán)與標(biāo)記在另一端的淬滅基團(tuán)緊緊靠近。熒光基團(tuán)被激發(fā)后產(chǎn)生的光子被淬滅劑淬滅，由熒光基團(tuán)產(chǎn)生的能量以紅外而不是可見(jiàn)光形式釋放出來(lái)。分子信標(biāo)的莖環(huán)結(jié)構(gòu)中，環(huán)一般為15-30個(gè)核苷酸長(zhǎng)，并與目標(biāo)序列互補(bǔ)；莖一般5-7個(gè)核苷酸長(zhǎng)，并相互配對(duì)形成莖的結(jié)構(gòu)。熒光基團(tuán)標(biāo)記在探針的一端，而淬滅劑則標(biāo)記在另一端。在復(fù)性溫度下，因?yàn)槟０宀淮嬖跁r(shí)形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)，當(dāng)加熱變性會(huì)互補(bǔ)配對(duì)的莖環(huán)雙鏈解開，如果有模板存在環(huán)序列將與模板配對(duì)。與模板配對(duì)后，分子信標(biāo)將成鏈狀而非發(fā)夾狀，使得熒光基團(tuán)與淬滅劑分開。當(dāng)熒光基團(tuán)被激發(fā)時(shí)，因淬滅作用被解除，發(fā)出激發(fā)光子。由于是酶切作用的存在，分子信標(biāo)也是積累熒光。
PCR-熒光探針?lè)?/strong>的雙雜交探針模式(FRET)：FRET探針又稱雙雜交探針，F(xiàn)RET探針由兩條相鄰探針組成，在一條探針端標(biāo)記FAM熒光基團(tuán)，另一探針端標(biāo)記Red640熒光基團(tuán)。當(dāng)復(fù)性時(shí)，探針結(jié)合在模板上，F(xiàn)AM基團(tuán)和Red640基團(tuán)相鄰，激發(fā)FAM產(chǎn)生的熒光，作為Red640基團(tuán)的激發(fā)光被吸收，使Red640發(fā)出波長(zhǎng)為640的熒光。當(dāng)變性時(shí)，探針游離，兩基團(tuán)距離遠(yuǎn)，不能產(chǎn)生640波長(zhǎng)的熒光。由于FRET探針是靠近發(fā)光，所以檢測(cè)信號(hào)是實(shí)時(shí)信號(hào)，非累積信號(hào)。
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