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Anti-Caspase-0 半胱胺酸蛋白酶-0抗體試驗(yàn)操作方法

點(diǎn)擊次數(shù):1236 更新時(shí)間:2022-03-22
 

Anti-Caspase-0 半胱胺酸蛋白酶-0抗體試驗(yàn)操作方法:

蛋白提樣品制備

1、 將培養(yǎng)液吸入至15 ml離心管中,于2500 rpm離心5 min。

2、 棄上清,加入5 ml PBS并用槍輕輕吹打洗滌,然后2500 rpm離心5 min。棄上清后用PBS重復(fù)洗滌一次。

3、 用槍吸干上清后,加100 μl裂解液(含PMSF)冰上裂解30 min,裂解過程中要經(jīng)常彈一彈以使細(xì)胞充分裂解。

4、將裂解液4℃、12000 rpm離心5 min,取上清分裝于0.5 ml EP管中并置于-20℃保存。

5、BCA法測蛋白濃度

SDS-PAGE電泳

1、 玻璃板對齊后放入夾中卡緊,然后垂直卡在架子上準(zhǔn)備灌膠。

2、按前面方法配10%分離膠,加入TEMED后立即搖勻即可灌膠。灌膠時(shí),可用10 ml槍吸取5 ml膠沿玻璃放出,待膠面升到綠帶中間線高度時(shí)即可。然后膠上加一層水,液封后的膠凝的更快。(灌膠時(shí)開始可快一些,膠面快到所需高度時(shí)要放慢速度。操作時(shí)膠一定要沿玻璃板流下,這樣膠中才不會有氣泡。加水液封時(shí)要慢,否則膠會被沖變型。)

3、 當(dāng)水和膠之間有一條折射線時(shí),說明膠已凝了。再等3 min使膠充分凝固就可倒去膠上層水并用吸水紙將水吸干。

4、 按方法配4%的濃縮膠,加入TEMED后立即搖勻即可灌膠。將剩余空間灌滿濃縮膠后將梳子插入孔槽。灌膠時(shí)也要使膠沿玻璃板流下以免膠中有氣泡產(chǎn)生。插梳子時(shí)要使梳子保持水平。待到濃縮膠凝固后,兩手分別捏住梳子的兩邊豎直向上輕輕將其拔出。

5、 用水沖洗濃縮膠,將其放入電泳槽中。

6、 測完蛋白含量后,計(jì)算含20-50 μg蛋白(根據(jù)自己的實(shí)驗(yàn)需要進(jìn)行選擇,沒有固定的量)的溶液體積即為上樣量。取出上樣樣品至200 μl的EP管中,加入5×SDS 上樣緩沖液至終濃度為1×。上樣前要將樣品于沸水中煮5-10 min使蛋白變性。

7、 加入足夠的電泳緩沖液后開始準(zhǔn)備上樣。(電泳液至少要漫過內(nèi)測的小玻璃板。)用微量進(jìn)樣器貼壁吸取樣品,將樣品吸出不要吸進(jìn)氣泡。將加樣器針頭插至加樣孔中緩慢加入樣品(包括一孔做可視的蛋白marker)。(加樣太快可使樣品沖出加樣孔,若有氣泡也可能使樣品溢出。加入下一個(gè)樣品時(shí),進(jìn)樣器需在外槽電泳緩沖液中洗滌數(shù)次,以免交叉污染)

8、電泳:濃縮膠時(shí)用80-100 V跑,到分離膠以后用150-200 V跑,總時(shí)間2 h左右,電泳至溴酚蘭剛跑出即可終止電泳,進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。

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風(fēng)疹病毒IgG抗體參考品

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澤瀉醇A-24-醋酸酯;Alisol A

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左旋千金藤啶堿;L-Stepholidi

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竹紅菌甲素;hypocrellin A

紫萁酮;Osmundacetone

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紫莖女貞苷B;Ligupurpurosi

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