ELISA試劑盒Hanks、D-Hanks液和消化液(胰酶液)的配制
一、 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>
熟練掌握Hanks、D-Hanks液等平衡鹽溶液的配制，了解消化液(胰酶液)的配制方法。
二、實(shí)驗(yàn)原理
Hanks液是常見的平衡鹽溶液(BSS)之一。D-Hanks液則是無(wú)鈣鎂離子的Hanks液。BSS與細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)下的pH值、滲透壓及無(wú)菌狀態(tài)一致，且配方簡(jiǎn)單，是組織培養(yǎng)基本用液，常用于配制培養(yǎng)基及其他用液，或洗細(xì)胞等，細(xì)胞在BSS中可生存幾個(gè)小時(shí)。胰蛋白酶(胰酸)溶液是一種常用的細(xì)胞消化液，原代培養(yǎng)時(shí)用于處理組織塊，使細(xì)胞分離下來(lái)。傳代時(shí)用胰蛋白酶使培養(yǎng)細(xì)胞離開所貼附的培養(yǎng)瓶表面，并分散成單個(gè)細(xì)胞。胰蛋白酶主要采自?；蜇i的胰臟，呈白色粉末狀，易潮解，應(yīng)在低溫干燥處保存。胰酶的活力常用一份胰酶解離酪蛋白的份數(shù)表示，常用胰酶活力為1：125或1：250。本實(shí)驗(yàn)室一般用1：250(GRC公司)。胰蛋白酶對(duì)細(xì)胞的分離效果與細(xì)胞的類型、特性和瓶壁表面特性有關(guān)。一般來(lái)說(shuō)濃度大、溫度高(勿高于37℃)、作用時(shí)間長(zhǎng)，則對(duì)細(xì)胞分離能力大。但超過(guò)一定程度會(huì)損傷細(xì)胞，導(dǎo)致細(xì)胞傳代后不能貼壁或死亡。胰酶在pH 8.0、37℃時(shí)消化能力zui強(qiáng)。溶液中的Ca2+、Mg2+和血清會(huì)降低胰酶活力，所以配制胰酶時(shí)須用無(wú)Ca2+、Mg2+的D-Hanks液。當(dāng)消化結(jié)束時(shí)，可加入少量血清或含血清的培養(yǎng)基以終止胰酶作用。細(xì)胞傳代使用的胰酶濃度是0.25%或0.2%。用于原代細(xì)胞培養(yǎng)消化組織塊則為0.1%或0.125%。
三、儀器、試劑和材料
材料：3 000 mL錐形瓶，25 mL、50 mL試劑瓶，500 mL輸液瓶，螺口蓋，翻帽塞，pH試紙，孔徑0.22μm的微孔濾膜。
試劑：NaCl，Na2HP04，KH2P04，KCl，酚紅，NaHC03，胰蛋白酶干粉，0.02%EDTA，CaCl2，D-葡萄糖，MgCh·6H20，MgS04·7H20，酚紅(0.1%)(配法：稱酚紅2 g，置于研磨器中，先用數(shù)滴5.6%的NaHCO3溶液溶解并研磨，再加進(jìn)該5.6%NaHC03溶液使zui終體積為100 mL。瓶裝保存，備用)。
儀器： 抽濾泵1套，過(guò)濾器1套，高壓滅菌鍋，量筒，磁力攪拌器，研磨器。
四、實(shí)驗(yàn)步驟
(一)配制D-Hanks液
1.按表2—3—5稱取D-Hanks試劑。
2.依次加入上述試劑至800 mL蒸餾水中，溶解后定容至1 1000 mL。 3.高壓滅菌，10磅10 min。
(二)配制Hanks液
1.按表2—3—5稱取Hanks試劑。
2.稱取一定量胰蛋白酶粉末于研磨器中(夏天時(shí)研磨器應(yīng)放在冰浴中)，加入少量D-Hanks液研磨1 000次左右，調(diào)制成糊狀。再放入4℃預(yù)冷的適量D-Hanks液中，4℃下磁力攪拌使*溶解。
3.用NaHC03干粉將胰酶溶液的pH值調(diào)至8.0左右(胰酶作用的zui適pH值)，并加入0.02%EDTA以協(xié)助消化作用。
4.濾過(guò)除菌(方法見二、培養(yǎng)基的配制)，-20℃凍存。
五、注意事項(xiàng)
1.BSS的pH值應(yīng)確定為7.2左右。
2.如配制的Hanks液高壓滅菌后液體變混，則可將100 mL的CaCl2與含有其他成分的液體分別裝瓶高壓滅菌之后，再在無(wú)菌條件下配制，定容。這樣可以避免高壓滅菌后液體變混。
3.胰酶受熱易失活，所以盡量避免盛夏配制，并且在配制過(guò)程中溫度應(yīng)始終保持在4℃左右。
4.胰酶研磨要充分，否則在過(guò)濾時(shí)會(huì)將較大的顆粒過(guò)濾掉，不能達(dá)到真正的濃度。
5.胰酶分裝時(shí)盡量分裝成多瓶，并遵守3次左右用完和只裝2/3體積的原則。因?yàn)槔鋬霰４鏁r(shí)體積會(huì)膨脹，而多次使用同一瓶胰酶反復(fù)凍融會(huì)降低消化效果并可能造成污染。
Ⅳ、傳代細(xì)胞培養(yǎng)與觀察
一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>
熟練傳代細(xì)胞的傳代方法及操作過(guò)程。
二、實(shí)驗(yàn)原理
傳代培養(yǎng)是指細(xì)胞從一個(gè)培養(yǎng)瓶以1：2或1：2以上的比例轉(zhuǎn)移，接種到另一培養(yǎng)瓶的培養(yǎng)。
細(xì)胞培養(yǎng)是一種操作繁瑣而又要求十分嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶?shí)驗(yàn)技術(shù)。要使細(xì)胞能在體外長(zhǎng)期生長(zhǎng)，必須滿足兩個(gè)基本要求：一是供給細(xì)胞存活所必需的條件，如適量的水、無(wú)機(jī)鹽、氨基酸、維生素、葡萄糖及其有關(guān)的生長(zhǎng)因子、氧氣、適宜的溫度，ELISA試劑盒注意外環(huán)境酸堿度和滲透壓的調(diào)節(jié)。二是嚴(yán)格控制無(wú)菌條件。
三、儀器、材料和試劑
儀器：CO2培養(yǎng)箱、倒置顯微鏡、超凈臺(tái)
材料：培養(yǎng)瓶、試管、移液管、巴士德吸管、廢液缸、75%酒精棉球、酒精燈、培養(yǎng)的細(xì)胞。
試劑：培養(yǎng)基RPMI1640、小牛血清、0.25%胰蛋白酶、Hanks液。
四、實(shí)驗(yàn)步驟
1、入無(wú)菌室之前用肥皂洗手，再用75% 的酒精擦拭消毒雙手;
2、倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，確定細(xì)胞是否傳代及細(xì)胞需要稀釋的倍數(shù)。 將培養(yǎng)用液37℃下預(yù)熱。
3、超凈臺(tái)臺(tái)面應(yīng)整潔，用75%酒精棉球擦拭清潔;
4、打開超凈工作臺(tái)的紫外燈照射臺(tái)面20min左右，關(guān)閉紫外燈，打開風(fēng)機(jī)清潔空氣出去臭氧;
5、點(diǎn)燃酒精燈;取出無(wú)菌試管，巴士德吸管和刻度吸管;安上橡皮頭;過(guò)酒精燈火焰略燒后插在無(wú)菌試管內(nèi)。
6、將培養(yǎng)用液瓶口用75%酒精消毒，過(guò)酒精燈火焰后斜置于酒精燈旁的架子上。
7、倒掉培養(yǎng)細(xì)胞的舊培養(yǎng)基。酌情可用2-3ml Hanks液洗去殘留的就培養(yǎng)基，或用少量胰酶涮洗一下。
8、每個(gè)大培養(yǎng)瓶加入1ml胰酶，小培養(yǎng)瓶用量酌減，蓋好瓶蓋后在倒置顯微鏡下觀察。當(dāng)細(xì)胞收回突起變圓時(shí)立即翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，使細(xì)胞脫離胰酶，然后將胰酶倒掉。注意勿使細(xì)胞提早脫落入消化液中。
9、加入少量的含血清的新鮮培養(yǎng)基，反復(fù)吹打消化好的細(xì)胞使其脫壁并分散，再根據(jù)分傳瓶數(shù)補(bǔ)加一定量的含血清的新鮮培養(yǎng)基(7-10ml/大瓶;3-5ml/小瓶)制成細(xì)胞懸液，然后分裝到新培養(yǎng)瓶中。蓋好瓶蓋，適度擰緊后稍回轉(zhuǎn)，以利于CO2的進(jìn)入，將培養(yǎng)瓶放回CO2培養(yǎng)箱。
10、對(duì)懸浮培養(yǎng)細(xì)胞，步驟7-9不做。直接將細(xì)胞懸液進(jìn)行離心去除舊培養(yǎng)基上清，加入新鮮培養(yǎng)基，然后分裝到各瓶中。
五、注意事項(xiàng)
1、傳代培養(yǎng)時(shí)注意無(wú)菌操作并防止細(xì)胞間的交叉污染。所有操作盡量靠近酒精燈火焰。每次只進(jìn)行一種細(xì)胞的操作。每種細(xì)胞使用一套器材。
2、每天觀察細(xì)胞形態(tài)，掌握好細(xì)胞是否健康的標(biāo)準(zhǔn)：健康細(xì)胞的形態(tài)飽滿，折光性好，生長(zhǎng)致密時(shí)即可傳代。
3、如發(fā)現(xiàn)細(xì)胞有污染跡象，應(yīng)立即采取措施，一般應(yīng)棄置污染的細(xì)胞，如果必須挽救，可加含有抗生素的BBS或培養(yǎng)基反復(fù)清洗，隨后培養(yǎng)基中加入較大量的抗生素，并經(jīng)常更換培養(yǎng)基。
Ⅴ、細(xì)胞的凍存與復(fù)蘇
一、 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>
掌握細(xì)胞保存的方法，能獨(dú)立地進(jìn)行細(xì)胞的凍存與復(fù)蘇操作。
二、實(shí)驗(yàn)原理
細(xì)胞凍存是細(xì)胞保存的主要方法之一。利用凍存技術(shù)將細(xì)胞置于-196℃液氮中低溫保存，可以使細(xì)胞暫時(shí)脫離生長(zhǎng)狀態(tài)而將其細(xì)胞特性保存起來(lái)，這樣在需要的時(shí)候再?gòu)?fù)蘇細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。而且適度地保存一定量的細(xì)胞，可以防止因正在培養(yǎng)的細(xì)胞被污染或其他意外事件而使細(xì)胞丟種，起到保種的作用。此外，還可以利用細(xì)胞凍存的形式購(gòu)買、寄贈(zèng)、交換和運(yùn)送某些細(xì)胞。
細(xì)胞凍存時(shí)向培養(yǎng)基中加入保護(hù)劑——終濃度5%-15% 的甘油或二甲基亞砜(DMSO)，可使溶液冰點(diǎn)降低，加之在緩慢凍結(jié)條件下，在細(xì)胞內(nèi)水分透出，減少了冰晶形成，從而避免細(xì)胞損傷。
采用“慢凍快融"的方法能較好的保證細(xì)胞的存活。標(biāo)準(zhǔn)冷凍速度為-1~-2℃/min，當(dāng)溫度低于-25℃時(shí)加速，到-80℃之后直接投入液氮內(nèi)(-196℃)。復(fù)蘇細(xì)胞時(shí)則直接將裝有細(xì)胞的凍存管投入40℃熱水中迅速解凍。
三、儀器、試劑和材料
儀器：4℃冰箱、-70℃冰箱、液氮容器、微量加樣器、水浴鍋、離心機(jī)。
材料：凍存管、細(xì)胞培養(yǎng)用材料、500ml燒杯、膠布、搪瓷杯、75%酒精棉球。
試劑：培養(yǎng)基RPMI1640、小牛血清、0.25%胰蛋白酶溶液、二甲基亞砜(DMSO)或甘油、0.5%臺(tái)盼籃染液、液氮。
四、實(shí)驗(yàn)步驟
(一)細(xì)胞凍存
1、取待凍存的細(xì)胞用胰酶消化，用培養(yǎng)基將細(xì)胞沖洗下來(lái)。800r/min離心5min，棄上清收集細(xì)胞。如果是懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞，可直接離心收集細(xì)胞。
2、加入適量?jī)龃嬉?10%甘油+90%培養(yǎng)基，或是10%DMSO+90%培養(yǎng)基)制成細(xì)胞懸液。細(xì)胞濃度宜大，3*106個(gè)/ml左右，并可適量增加小牛血清濃度至20%。
3、細(xì)胞懸液裝入凍存管中。用膠布封裹，做好標(biāo)記(注明細(xì)胞種類、時(shí)間、條件等)。
4、凍存管在4℃下存放30min，轉(zhuǎn)放-20℃1.5h~2h，再轉(zhuǎn)入-70℃4~12h后即可轉(zhuǎn)入液氮內(nèi)(-196℃)，注意進(jìn)行登記。
(二)細(xì)胞復(fù)蘇
1、取一搪瓷杯盛上適量自來(lái)水加熱至40℃左右。
2、從液氮中取出凍存管立即投入40℃水中迅速解凍。
3、取出凍存管，用75%酒精清潔管口，打開。
4、離心去上清收集細(xì)胞，用無(wú)血清培養(yǎng)基洗1次，加入3ml新鮮培養(yǎng)基，于小培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。
5、每日觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，ELISA試劑盒如果死細(xì)胞較多，復(fù)蘇次日應(yīng)換液。待細(xì)胞長(zhǎng)滿后進(jìn)行傳代培養(yǎng)。
五、注意事項(xiàng)
1、在使用含有DMSO的凍存液時(shí)，因?yàn)镈MSO在室溫狀態(tài)易損傷細(xì)胞，所以在細(xì)胞加入凍存液后應(yīng)盡快放入4℃環(huán)境中。
2、準(zhǔn)確記錄細(xì)胞的種類、凍存時(shí)間、凍存液的品種和凍存者信息。
小結(jié)：這里總結(jié)了動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的從器材消毒、試劑配制、細(xì)胞的凍存復(fù)蘇操作技術(shù)，希望對(duì)大家有用。
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