1.血液的收集及洗滌
將血液收集在含有抗凝劑的容器中，每30mL 血液加約5mL 肝素－pH7.4等滲磷酸鹽緩沖溶液。
為避免膜上含有的或膜上吸附的蛋白酶使培養(yǎng)基膜蛋白發(fā)生變化，以下操作應(yīng)在－4℃低溫下進(jìn)行。取30mL血液，于冷凍離心機(jī)(4℃)中3000r/min 離心20min，使紅細(xì)胞沉淀，用吸管吸盡血漿及沉淀的紅細(xì)胞表層的絨毛狀沉淀層，以避免其他類型細(xì)胞的混入。
將紅細(xì)胞置于3倍量預(yù)冷的pH7.4等滲磷酸鹽緩沖液中，用玻璃棒緩慢地?cái)嚢钁腋。?℃5000r/min離心15min，除去上清液及沉淀表層，重復(fù)洗滌3次。
2.溶血和紅細(xì)胞膜的洗滌
在洗凈的紅細(xì)胞中，按照1:40的比例加入預(yù)冷的10mmol/LpH7.4低滲Tris(三羥甲基氨基甲烷)－HCl 緩沖液，邊加邊緩慢攪拌，置于4℃冰箱中1～2h，使之完成溶血。然后于4℃9000r/min 離心15min，使紅細(xì)胞膜沉淀。重復(fù)洗滌、離心3～5次，zui后獲得白色的紅細(xì)胞膜樣品。
注意：①溶血時(shí)低滲緩沖液的用量越大，培養(yǎng)基紅細(xì)胞膜中血紅蛋白的殘留量越少，但體積大，離心費(fèi)時(shí)間。因此，紅細(xì)胞與緩沖液的容量比例，以1:40為宜。②膜的重量很輕，在溶血后離心傾倒上清液時(shí)容易流走，因此要特別小心，盡可能防止膜的損失。③在制備過程中，若pH 值降低，殘留的血紅蛋白會(huì)迅速增加。當(dāng)pH 保持在7.4時(shí)，紅細(xì)胞膜中的血紅蛋白含量?jī)H占總蛋白量的3~5％，相當(dāng)于血液中總血紅蛋白的0.1％。但pH 值降低至7.0時(shí)，血紅蛋白增加至20％。④上述方法適用于大白鼠和人紅細(xì)胞膜的分離。牛、豬等紅細(xì)胞膜的制備，若反復(fù)進(jìn)行低滲處理，將造成膜外表面包含具有乙酰膽堿酯酶活性的酯蛋白脫落，使膜容易破碎，得不到較完整的膜樣品。若在低滲緩沖液中加入1mmoL氯化鈣，即可*防止這種膜的不穩(wěn)定性。
將zui后一次離心所得到的紅細(xì)胞培養(yǎng)基膜懸浮在2～4mLpH7.4等滲磷酸鹽緩沖液中。記錄懸浮液的總體積。注意，有時(shí)在膜的下面有少許未解體的紅細(xì)胞殘留物，不要將這部分殘留物懸浮在緩沖液中。
3.細(xì)胞膜的鏡檢
取少量膜樣品懸液，在相差顯微鏡下進(jìn)行觀察，確定膜制品是否純凈。在視野中純凈的膜為扁圓形，白色，膜表面賂有皺紋。在視野中應(yīng)不含有完整的紅細(xì)胞或污染的細(xì)菌。
4.膜的冷凍干燥
培養(yǎng)基樣品放在一個(gè)稱好重量的(在分析天平上準(zhǔn)確稱量)小稱量瓶中，冷凍干燥至樣品全干(冰凍干燥可以過夜，冷凍干燥的樣品更易溶于SDS 溶液中)，稱量帶有冷凍干燥制品的小稱量瓶，記錄膜的產(chǎn)量。
將冷凍干燥的膜制品，置于干燥器中保存，以備膜結(jié)構(gòu)成分的分析。
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