研生試劑-FITC（異硫氰酸熒光素）
異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate, FITC)
純品為黃色或橙黃色結(jié)晶粉末，易溶于水和酒精溶劑。有兩種異構(gòu)體，其中異構(gòu)體Ⅰ型在效率、穩(wěn)定性與蛋白質(zhì)結(jié)合力等方面都更優(yōu)良。FITC分子量為389.4，zui大吸收光波長為490～495nm，zui大發(fā)射光波長為525～530nm，呈現(xiàn)明亮的黃綠色熒光。FITC在冷暗干燥處可保存多年，是目前應(yīng)用zui廣泛的熒光素。其主要優(yōu)點(diǎn)是人眼對(duì)黃綠色較為敏感，通常切片標(biāo)本中的綠色熒光少于紅色。
FITC 是在熒光素的基礎(chǔ)上通過化學(xué)反應(yīng)增加硫氰酸基團(tuán)得到的，硫氰酸基團(tuán)可以和生物活性物質(zhì)例如蛋白質(zhì)上的伯胺基團(tuán)反應(yīng)形成硫脲鍵，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)生物活性物質(zhì)的熒光標(biāo)記
FITC相關(guān)事項(xiàng)
分子式：C21H11NO5S
分子量：389.38
性質(zhì)：
1. 外觀：黃色粉末
2. 純度：≥95% （HPLC）
3. 產(chǎn)品描述：FITC能和各種抗體蛋白結(jié)合，結(jié)合后的抗體不喪失與一定抗原結(jié)合的特異性，并在堿性溶液中具有強(qiáng)烈的黃綠色熒光。通過在熒光顯微鏡下觀察或流式細(xì)胞儀分析可對(duì)相應(yīng)抗原進(jìn)行定性、定位或定量的檢測。用于醫(yī)學(xué)，農(nóng)學(xué)和畜牧等方面，可對(duì)由細(xì)菌病毒和寄生蟲等所致疾病進(jìn)行快速診斷。
4. FITC標(biāo)記抗體流程：
（1）將待交聯(lián)的蛋白（濃度≥1mg/ml）對(duì)交聯(lián)反應(yīng)液透析三次4℃，至pH=9.0。交聯(lián)反應(yīng)液配制方法：7.56g NaHCO3，1.06g Na2CO3，7.36g NaCl，加水定容至1 L。
（2）將FITC溶于DMSO中，濃度為1mg/mL。每次交聯(lián)使用的FITC均應(yīng)新鮮配制，避光。
（3）按P:F（蛋白質(zhì):FITC）=1mg:150μg 的比例將FITC緩慢加入于抗體溶液中，邊加邊輕輕晃動(dòng)使其與抗體混合均勻，暗處4 ℃反應(yīng)8 h。
（4）加入5mol/L的NH4Cl至終濃度50mmol/L， 4 ℃終止反應(yīng)2 h。
（5）將交聯(lián)物在PBS中透析四次以上，至透析液清亮。
（6）交聯(lián)物的鑒定
蛋白濃度（mg/mL） = [ A280– 0.31×A495 ] / 1.4
F/P比例: 3.1×A495 / [A280 – 0.31×A495 ]，該值應(yīng)介于2.5 ~ 6.5之間。
（7）FITC交聯(lián)的蛋白應(yīng)置于pH 7.4的磷酸鹽緩沖液中，加入0.1% NaN3、1% BSA，4℃避光保存。 儲(chǔ)存條件：4℃避光保存
FITC是一種常用的綠色熒光探針。FITC的吸收(激發(fā))和發(fā)射峰參見下表。
Fluorophore Absorption Peak(nm) Emission Peak(nm)
FITC 492 520
當(dāng)FITC在堿性溶液中與抗體蛋白反應(yīng)時(shí)，主要是蛋白質(zhì)上賴氨酸的r氨基與熒光素的硫碳胺鍵(thiocarbmide)結(jié)合，形成FITC-蛋白質(zhì)結(jié)合物，即熒光抗體或熒光結(jié)合物。一個(gè)IgG分子中有86個(gè)賴氨酸殘基，一般zui多能結(jié)合15～20個(gè)，一個(gè)IgG分子可結(jié)合2～8個(gè)分子的FITC，其反應(yīng)式如下
FITC-N=C=S + N-H2-蛋白質(zhì) → FITC-NS-C-N-H2-蛋白質(zhì)
常用Marsshall(1958)法標(biāo)記熒光抗體，也可以根據(jù)條件采用Chadwick等標(biāo)記法或Clark等(1963)的透析標(biāo)記法。
1．Marsshall法
(1)材料 抗體球蛋白溶液、0．5mol／L(pH9．0)碳酸鹽緩沖液、無菌生理鹽水、異硫氰酸熒光
素、1％硫柳汞水溶液、50ml小燒杯、4℃冰箱、電磁攪拌器、透析袋、玻棒、pH7．2或 3．0的0．01mol／LPBS等。
(2)方法及步驟 ①抗體的準(zhǔn)備 取適量已知濃度的球蛋白溶液于燒杯中，再加人生理鹽水及碳酸鹽緩沖液，使zui后免疫球蛋白濃度為20mg／ml，碳酸鹽緩沖液容量為總量的1／10，混勻，將燒瓴置電磁攪拌器上(速度適當(dāng)以不起泡沫為宜)5～10min。
②熒光素的準(zhǔn)備 根據(jù)欲標(biāo)記的蛋白質(zhì)總量，按每毫克免疫球蛋白加0．01mg熒光色素，用分析天平準(zhǔn)確稱取所需的異硫氰酸熒光素粉末。也可用下述公式計(jì)算出免疫球蛋白、熒光素的量，還可以算出需加緩沖液的量。
a．蛋白溶液：含量Amg／m1；容積Bml。
b．總蛋白量(AXB)＝Crag。
c．C／20～C／10＝Dmg(如蛋白含量低于20mg／ml，用C／10；如高于20mg／ml，用C／20)。
d．熒光素FITC的量：(1／50～2／100)XC＝Emg。
e．巳0．5mol／L(pH9．5)碳酸鹽緩沖液D／10＝Fml。
f． PBS量D-(B+F)=Gml。
注：A為蛋白含量，mg／ml；B為蛋白質(zhì)溶液的容積；C為蛋白總量，mg；D為常數(shù)，mg；正為熒光素的量，mg；F為碳酸鹽緩沖液的容積，ml；G為PBS的容積，ml。
③結(jié)合(或標(biāo)記) 邊攪拌邊將稱取的熒光色素漸漸加入球蛋白溶液中，避免將熒光素粘于燒瓶壁(大約在5—10min內(nèi)加完)，加完后，繼續(xù)避光攪拌12h左右。結(jié)合期間應(yīng)保持蛋白溶液于4℃左右，故需將燒杯和攪拌器一起移人4℃冰箱中。
④透析 結(jié)合完畢后，將標(biāo)記的球蛋白溶液離心(2500r／min)20rain，除去其中少量的沉淀物，裝入透析袋中，再置于燒杯中，用pH8．0緩沖鹽水透析(0～4~C)過夜。
⑤過柱 取透析過夜的標(biāo)記物，通過葡聚糖凝膠SephadexG-25或G—50柱，分離游離熒光素，收集標(biāo)記的熒光抗體進(jìn)行鑒定。洗脫液：0．01mol／L磷酸鹽緩沖液(pH7．2)；過濾量：12ml標(biāo)記蛋白液(過濾前未透析)；收集量：20ml(稀釋1．7倍左右)。
2．Chadwick法
(1)試劑和材料 抗體球蛋白溶液、異硫氰酸熒光素、3%碳酸鈉水溶液、0．01mol/L pH8.0PBS、1%硫柳汞、離心機(jī)及離心管、燒杯（25ml）攪拌器、無菌吸管，無菌吸管及毛細(xì)滴管、燒杯（500ml）透析袋等。
(2)方法及步驟 ①抗體準(zhǔn)備 用o～4~C的pH8。0磷酸鹽緩沖鹽水將球蛋白溶液稀釋至濃度為30～40mg／ml，置入25ml燒杯內(nèi)，放于冰槽中。
②熒光色素準(zhǔn)備 按每毫克免疫球蛋白加入熒光素0．01rug計(jì)算，稱取所需的熒光素，用3％碳酸鈉水溶液溶解。
③將準(zhǔn)備的抗體與熒光色素溶液等量混合，充分?jǐn)噭?，在o～4~C冰箱中結(jié)合(在磁力攪拌機(jī)上持續(xù)攪拌)18～24h。
④透析和柱層析 方法同Marsshall法。
3．改良法
(1)試劑和材料 ①0．01mol／L(pH7．2)PBS配法中，校定pH至7．2。NaCi 18g、Na2HP04 1．15g，溶于2000ml蒸餾水
②0．5mol／L(pH9．0)碳酸鹽緩沖液配法 取0．5mol／LNazCOs(5．3％)10ml加入0．5mol／LNaHC03(4．2％)90ml，混合后，校定pH至9．0。
③3％碳酸鈉水溶液配法 稱L 5g無水碳酸鈉充分溶解于50ml滅菌蒸餾水中即成。
④其他試劑和材料 l％*、離心機(jī)及離心管、燒杯(25m1)、攪拌器、無菌吸管及毛細(xì)滴管、燒杯(500m1)透析袋等。
(2)方法及步驟 ①取價(jià)的抗人球蛋白兔免疫血清，分離球蛋白，用鹽水(0．15mol／LNaCl)及緩沖液(0．5mol／LNaHC03—Na2C03，pH9．0)稀釋使每毫升內(nèi)含蛋白質(zhì)lOmg，緩沖液為總量的10％，降溫至4℃。
②加入異硫氰酸鹽(FITC)熒光素[蛋白：熒光素＝(50—80)mg‘lmg]，在0～4~C
下電磁攪拌12～14h。
③然后用半飽和的硫酸銨將標(biāo)記球蛋白沉淀分離，除去未結(jié)合的熒光素，再用緩沖鹽水透析，除去硫酸銨(用Nessler試劑測驗(yàn)，至隔夜透析的鹽水無氨離子及熒光色素為止)。
④將制備好的熒光抗體加*o．01％，分裝在lml安瓿中，或凍干，保存于冰箱中(4℃)可以用半年以上，一20~C保存可達(dá)2年以上。
4．透析標(biāo)記法
此法適用于小量抗體的熒光素標(biāo)記，標(biāo)記簡便，非特異性染色較少。
(1)試劑和材料 試劑和材料同改良法。
(2)方法及步驟 ①用0．025mol／L碳酸鹽緩沖液pH9．0，將欲標(biāo)記免疫球蛋白稀釋成1％濃度，裝入透析袋中。
②用同一緩沖液將FITC配成0．1mg／ml的溶液，按10mg／ml球蛋白溶液體積的10倍，將FITC稀釋液盛于圓柱形容器內(nèi)，并使透析袋浸沒于FITC液中。
③容器頂端蓋緊，底部放攪拌棒，在4~C電磁攪拌下透析標(biāo)記24h。取出透析袋中標(biāo)記液，即刻用SephadexG50凝膠過濾，去除游離熒光素，分裝，貯存于4℃中。
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